機能性化粧品素材開発のための実験プロトコール集
技術者・研究者のための技術書籍紹介
発刊日 2010年6月 ISBN978-4-7813-0248-5
体 裁 B5判，257頁
刊行にあたって
化粧品，医薬部外品の開発に安全性および有用性評価は避けては通れない開発の過程である。
2009年3月，EUでは化粧品指令の7次改正が施行され，動物試験による化粧品製剤と配合原料の安全性，有用性評価はほぼ全面的に禁止された。この流れはEU内にとどまらず将来，アジア諸国へ伝播することは必至である。このような国際的な環境変化は動物を使用しない安全性評価法と有用性評価法の確立に拍車をかけている。特に安全性評価については再生表皮モデルや再生角膜上皮モデルを用いた評価法が開発され，既に一部の試験法はOECDのガイドラインとして採用されている。さらに感作性試験法についても国内において開発されたh-CLAT法が国際標準へなるためのvalidation過程に入っている。
また，有用性試験においても従来，動物試験において評価されていた美白試験や抗シワ試験を，再生皮膚モデルによる評価に切り替えつつある。
さらに，皮膚有用性項目についても近年，多様化の傾向を示し，その多様性に対応するための評価法の確立が精力的に実施されているのが現状である。
本書は『機能性化粧品素材開発のための実験法―in vitro／細胞／組織培養―』（2007年5月，シーエムシー出版発行）の姉妹本として実験書に特化して企画された。本書は，近年の皮膚有用性の多様化に対応して角層から真皮まで，さらには毛髪，皮脂腺にいたるまで，有効成分のあるいは有効成分を配合した最終製剤の作用を評価するための，さらには安全性評価するための動物試験代替法に関する実験書である。
試験の背景については上記の姉妹本を参照することとし，本書では各実験法の原理をわかりやすく解説し，読者が本書を参照することにより実験を実施できることを特長としている。そのため，各試験法は試験の原理，試薬の調製，実験の操作および試験法に係わる文献にて構成されている。
本書が，化粧品開発に携わる研究者の皆さんの有用性，安全性評価実験の一助となれば幸いである。
（「はじめに」より）
2010年6月 （株）コスモステクニカルセンター 正木 仁
書籍の内容
目次
【第1編 表皮関連実験法】
第1章 脂質分析実験法
■試験
1.1.1 皮脂分析（薄層板クロマトグラフィー（TLC）法）
1.1.2 再生表皮モデルの細胞間脂質分析法
1.1.3 ESRによる角層ラメラ構造膜流動性測定
1.1.4 リポソームからの蛍光物質漏出を指標としたラメラ構造安定性評価
第2章 角層細胞分析実験法
■試験
1.2.1 有核細胞染色
1.2.2 重層剥離染色
1.2.3 カルボニル化タンパク染色
1.2.4 角層細胞のAdvanced glycation end products（AGEs）染色法
1.2.5 SH染色
1.2.6 角層細胞コーニファイドエンベロープのインボルクリン染色
1.2.7 角層細胞コーニファイドエンベロープのNile red染色
1.2.8 角層プロテアーゼ活性の測定法
1.2.9 角層中のカテプシンD活性測定法
1.2.10 遊離アミノ酸定量法
第3章 角化マーカー関連実験法
■試験
1.3.1 セリンパルミトイルトランスフェラーゼ（SPT）活性測定法
1.3.2 セリンパルミトイルトランスフェラーゼmRNA発現評価
1.3.3 タイトジャンクションの形成・機能の評価法
1.3.4 フィラグリンタンパク定量法（ドットブロット法）
1.3.5 プロフィラグリンmRNA発現評価
1.3.6 ・再生表皮モデルを用いたTEWLの測定方法
・再生表皮モデルを用いた皮膚バリア機能破壊モデルの調整法
第4章 毛穴関連実験法
1.4.1 ストレスファイバー染色
1.4.2 細胞内カルシウム濃度測定の試験法
【第2編 美白関連実験法】
第1章 メラノサイトに関する実験法
■試験
2.1.1 ヒトメラノサイトのtyrosinase活性抑制
2.1.2 B16メラノーマ細胞を用いたメラニン産生抑制評価
2.1.3 ヒトメラノサイトのDNA合成能の評価
2.1.4 ヒトメラノサイトのメラニン合成能の評価
2.1.5 メラノサイトのデンドライト形成阻害評価法
2.1.6 イノシトール3リン酸産生量の測定
第2章 ケラチノサイトに関する実験法
■試験
2.2.1 UVB照射ヒト培養ケラチノサイト由来のメラノサイト活性化抑制評価
第3章 再生皮膚モデルに関する実験法
2.3.1 3次元培養皮膚モデルを用いたメラニン産生抑制剤評価法
【第3編 抗老化実験法】
第1章 細胞外マトリックス合成関連実験法
■試験
3.1.1 ヒドロキシプロリン（Hydroxyproline）によるコラーゲン定量
3.1.2 I型コラーゲン定量（ELISA）
3.1.3 I型コラーゲンmRNA発現 RT-PCR
3.1.4 ヒト真皮線維芽細胞におけるIV型コラーゲン産生促進を指標とした実験法
3.1.5 三次元培養皮膚モデルを用いた評価法
3.1.6 ヒアルロン酸合成評価法
3.1.7 コラーゲンゲルの作製とゲル収縮活性測定法
第2章 細胞外マトリックス分解関係実験法
■試験
3.2.1 各刺激による線維芽細胞の誘導MMP-1（UVA，サイトカイン）：FITC-ラベルコラーゲンを用いたMMP-1活性測定
3.2.2 各刺激による線維芽細胞の誘導MMP-1：ウエスタンブロット法を用いたMMP-1の分析
3.2.3 MMP-1,2,9のmRNA発現
3.2.4 好中球エラスターゼ活性抑制作用の測定方法
3.2.5 線維芽細胞由来エラスターゼ活性抑制作用の測定方法
第3章 DNA傷害関連実験法
■試験
3.3.1 コメットアッセイによるDNA損傷評価実験法
3.3.2 UVBによるDNA傷害評価法（8-OHdG）
【第4編 活性酸素関連実験法】
第1章 化学的実験法
■試験
4.1.1 ESRを用いたスーパーオキシドアニオン検出法／消去活性評価法
4.1.2 スーパーオキサイド消去剤評価法1（チトクロームc法）
4.1.3 スーパーオキサイド消去剤評価法2（NBT法）
4.1.4 スーパーオキサイド消去剤評価法3（NBT法を用いた活性染色）
4.1.5 吸光度変化の測定によるカタラーゼ活性の測定
4.1.6 ESRを用いたヒドロキシラジカル検出法／消去活性評価法
4.1.7 ESRを用いたペルオキシラジカル検出法／消去活性評価法
4.1.8 ESRを用いた一重項酸素検出法／消去活性評価法
4.1.9 一重項酸素消去剤評価法1（近赤外領域の発光の検出）
4.1.10 一重項酸素消去剤評価法2（一重項酸素との反応性生物を測定する方法）
4.1.11 DPPHラジカルを用いたラジカル除去能測定法
第2章 生物学的実験
■試験
4.2.1 過酸化水素による細胞傷害評価法
4.2.2 脂質過酸化物（t-Butyl hydroperoxide）による細胞傷害評価法
4.2.3 一重項酸素による細胞傷害評価法
4.2.4 UVBによる細胞傷害評価法
4.2.5 細胞内活性酸素測定―UVB照射時の細胞内過酸化水素の検出
【第5編 ニキビ関連実験法】
第1章 P.acnesに対する実験法
■試験
5.1.1 Propionibacterium acnes（P.acnes）抗菌作用評価，阻止円法
5.1.2 Propionibacterium acnes（P.acnes）最小発育阻止濃度（MIC）
5.1.3 Propionibacterium acnes（P.acnes）増殖抑制効果，濁度法
5.1.4 Propionibacterium acnes（P.acnes）リパーゼ活性
第2章 培養細胞を用いた実験法
■試験
5.2.1 ハムスターおよびヒト皮脂腺の組織片培養法
5.2.2 ハムスター皮脂腺由来培養脂腺細胞，脂質合成量の評価法
【第6編 育毛剤実験法】
第1章 生化学実験法
■試験
6.1.1 皮脂腺に関連した5alpha-reductase阻害作用評価法
第2章 培養細胞を用いた実験法
■試験
6.2.1 ヒト毛包上皮系細胞の単離・培養と増殖を指標にした育毛剤評価実験法
6.2.2 ヒト毛乳頭細胞の単離・培養と育毛剤評価実験法
6.2.3 ヒト毛乳頭細胞におけるFGF-7発現亢進を指標とした実験法
6.2.4 マウスSC-3細胞株を用いた抗Androgen作用の評価法
第3章 培養器官を用いた実験法
■試験
6.3.1 毛包器官培養を用いた育毛剤評価実験法（ヘマトキシリン-エオジン染色）
6.3.2 毛包器官培養を用いた育毛剤評価実験法（TUNEL染色法）
6.3.3 毛包器官培養を用いた育毛剤評価法（BrdU取り込みによるDNA合成部位の測定）
【第7編 動物代替法安全性実験法】
第1章 皮膚腐食性試験法
■試験
7.1.1 再生表皮モデルを用いた皮膚腐食性試験法
第2章 皮膚一次刺激性試験法
7.2.1 再生表皮モデルを用いた皮膚一次刺激性試験法
第3章 眼刺激性実験法
7.3.1 SIRC-NRU試験法
7.3.2 再生眼上皮モデルを用いた眼刺激性試験法
7.3.3 Short Time Exposure（STE）試験
第4章 光毒性試験実験法
■試験
7.4.1 3T3 NRUの光毒性試験法
第5章 皮膚アレルギー性実験法
■試験
7.5.1 タンパク結合性評価
7.5.2 THP-1細胞を用いたin vitro皮膚アレルギー性試験法，human Cell Line Activation Test（h-CLAT）
