シングルセル解析の最前線
技術者・研究者向けの専門書籍紹介
発刊日 2010年3月 ISBN978-4-7813-0203-4 C3045
体 裁 B5判，286頁
刊行にあたって
この著は，2006年12月27日に刊行された「一細胞定量解析の最前線―ライフサーベイヤ構築に向けて―（監修：神原秀記，松永 是，植田充美）」の続編としてまとめられたものである。「ライフサーベイヤ」という言葉は，ヒトゲノム解析に世界で先鞭をつけられたゲノムセンターの和田昭允博士のヒトゲノム解析研究の展開を位置づけた新しいキーワードで，これを旗頭に，和田博士とヒトゲノム解析を強力に推進した神原秀記博士のもとで，気鋭の産学官の研究者が初めて結集した平成17〜20年度文部科学省科学研究費補助金「特定領域研究：生体分子群のデジタル精密計測に基づいた細胞機能解析―ライフサーベイヤをめざして」で得られた研究成果から公表可能なものを集大成したものである。
時代は今まさに，ゲノムデータをベースにして大きく変わろうとしており，生命の機能を分子レベルで，さらに，時空間の変動を網羅的に理解しようとする方向に研究動向があわただしくなってきている。分子レベルでの生命の理解は，アナログ的平均値として理解されてきた集団としての細胞レベルの研究から，個々の細胞内の個々の分子の動態を網羅的に，かつ，デジタルに定量解析して，システムとして理解することが必要となってきた。これには，物理，化学，生物，工学など幅広い分野の人と知識と技術のネットワークが必須であり，侵襲的な実測データの測定と非侵襲的な手法のマッチングの検証も必要となっている。
この続編では，実際，細胞内反応を非侵襲的に可視化するプローブの開発および化学物質合成技術の開発，個々の細胞間情報交換と応答を解明する細胞アレイ関連技術および1細胞内の全てのmRNA，タンパク質，代謝産物を一網打尽に検出し機能を探索するなどの基盤技術開発の成果の最先端を中心にまとめられている。
本分野でご活躍中の先生方には，ご多忙の中，ご執筆・ご寄稿していただき，まさに「シングルセル解析」の新しい研究拠点として，また，この研究領域を開拓する同志として，ご協力に深謝いたします。
（「はじめに」より）
2010年1月29日
東京農工大学 大学院工学教育部・連携大学院；（株）日立製作所 神原秀記
東京農工大学大学院 共生科学技術研究院 松永 是
京都大学大学院 農学研究科 応用生命科学専攻 植田充美
書籍の内容
第1章 細胞機能解析を目指した分子ツールの構築
1. 生体シグナル解析用分子ツールの構築（石田善行，王子田彰夫，浜地格）
1.1 はじめに
1.2 ハイパーリン酸化タンパク質の選択的蛍光検出
1.3 ATPセンサー
1.4 おわりに
2. 生体シグナル解析用の機能性核酸センサーの定量的デザイン（中野修一，杉本直己）
2.1 はじめに
2.2 ハイブリダイゼーションを利用したRNA発現の解析
2.3 生体シグナル検出のためのモデル実験系の必要性
2.4 分子クラウディング環境における核酸のハイブリダイゼーション
2.5 分子クラウディング環境における核酸のフォールディング
2.6 展望
3. タンパク質・細胞分析用デザインペプチドチップ（臼井健二，菊池卓哉，三原久和）
3.1 デザインペプチドを用いたプロテインチップと細胞チップ
3.2 タンパク質機能解析用チップへ向けた設計ペプチドアレイの構築
3.3 タンパク質機能解析用プロテインチップの応用例
3.4 細胞の生理的活動解析用チップに向けて
3.5 シングルセル観察による細胞の生理的活動解析用チップに向けて
3.6 おわりに
4. 細胞内可視化・ハイスループット検出系創出のための効率的細胞導入法（二木史朗）
4.1 はじめに
4.2 ピレンブチレート存在下にアルギニンペプチドベクターを利用する導入法
4.3 pH感受性膜融合ペプチドとカチオン性リポソームを併用する方法
5. 生体分子の高次デジタル計測を実現する光機能性プローブの開発とその応用（浦野泰照）
5.1 はじめに
5.2 分子内光誘起電子移動に基づく蛍光プローブの論理的精密設計法の確立
5.3 各種活性酸素種（ROS），および関連酵素活性の選択的検出を可能とする蛍光プローブの論理的開発
5.4 TokyoGreen骨格の創製に基づく，各種加水分解酵素・反応可視化蛍光プローブの開発
5.5 今後の展望
6. 生体分子と生理機能を可視化するタンパク質再構成法（小澤岳昌）
6.1 はじめに
6.2 タンパク質再構成法の原理と再構成可能な蛍光タンパク質の種類
6.3 蛍光タンパク質再構成法の応用例
6.4 発光タンパク質再構成法とその応用例
6.5 プロテアーゼ活性検出プローブ
6.6 まとめ
7. 多機能ケージド化合物の開発（古田寿昭）
7.1 ケージド化合物とは
7.2 光分解性保護基について
7.3 機能性ケージド化合物の設計と合成
7.4 今後の展開
8. 機能性MRIプローブのデザイン・合成によるinvivoイメージングツール（菊地和也，水上進）
8.1 はじめに
8.2 19FMRIを用いた酵素反応の検出
8.2.1 MRIによる酵素活性の可視化
8.2.2 加水分解酵素活性の19FMRI検出の原理
8.2.3 カスパーゼ-3活性を検出する19FMRIプローブの開発
8.3 おわりに
9. DualFRET法を利用した複数の生理機能イメージング（永井健治）
9.1 はじめに
9.2 原理
9.3 準備
9.3.1 観察試料
9.3.2 顕微観察システム
9.4 プロトコール
9.4.1 参照蛍光スペクトルデータの取得
9.4.2 DualFRET観察
9.4.3 蛍光の分離
9.4.4 実験例
9.5 おわりに
第2章 シングルセル解析技術を用いた細胞シグナル研究
1. 集積型細胞チップを用いた単一細胞シグナル解析（山村昌平，八代聖基，SathuluriRamachandraRao，片岡正俊，民谷栄一）
1.1 はじめに
1.2 単一細胞の機能解析を目指したマイクロチップデバイス
1.2.1 集積型一細胞アレイチップを用いた単一細胞シグナル解析
1.2.2 集積型細胞チップを用いた感染症診断システム
1.2.3 マイクロ流路型細胞チップを用いた単一細胞機能解析システム
1.3 まとめ
2. 磁性ナノ微粒子を用いた細胞機能計測（本多裕之）
2.1 はじめに
2.2 液滴ハンドリング
2.2.1 使用したPCRデバイス
2.2.2 On-chipRT-PCR実験
2.3 細胞アレイ
2.3.1 モデルがん細胞と磁性微粒子
2.3.2 3D培養でのがん細胞の挙動評価
2.3.3 抗がん剤感受性評価
3. 分化誘導細胞によって形成した神経回路の電気活動（神保泰彦，高山祐三）
3.1 神経系の再生医療
3.2 神経回路活動の計測
3.3 分化誘導細胞の培養
3.4 神経回路形成過程における自発電気活動
3.5 分化誘導神経回路の伝達物質
3.6 分化誘導細胞によって形成された神経回路
4. 細胞操作・解析用MEMSデバイスの研究開発（殿村渉，小西聡）
4.1 はじめに
4.2 細胞ネットワークシグナル解析用マイクロチャンネルアレイ
4.2.1 マイクロチャンネルアレイ構造
4.2.2 設計・製作
4.2.3 神経細胞ネットワーク形成とそのシグナル多点同時計測
4.3 細胞群位置制御用マイクロチャンネルアレイ
4.3.1 磁路一体化微小孔アレイ
4.3.2 設計・製作
4.3.3 細胞群・単一細胞の磁気による位置制御
4.4 おわりに
5. 電気化学計測技術を応用したシングルセル呼吸機能解析と応用（阿部宏之）
5.1 はじめに
5.2 マイクロ電極を用いた細胞呼吸測定装置
5.3 単一受精卵の呼吸量測定
5.4 呼吸測定による受精卵の品質評価
5.5 呼吸測定システムの医療応用
5.6 シングルセル呼吸測定と細胞間ネットワーク解析
5.7 おわりに
6. フェムトインジェクションを利用した多層化筋線維形成における細胞間ネットワーク解析（斉藤美佳子）
6.1 はじめに
6.2 マウスES細胞からの多層化筋線維の形成
6.3 フェムトインジェクション法
6.4 フェムトインジェクションを用いた多層化筋線維の細胞間連絡解析
6.5 おわりに
7. シングルセル解析のための2次元SPRイメージング技術の開発（鈴木正康）
7.1 シングルセル解析のためのバイオセンシング技術
7.2 シングルセル解析のための高解像度2次元SPRイメージングセンサ
7.3 シングルセル解析のための高感度2次元SPR免疫センシング
7.4 シングルセル応答の直接2次元SPRイメージング
7.5 シングルセル総合解析のためのSPR・蛍光デュアルイメージング
7.6 まとめ
8. 骨格筋細胞分化における単一細胞からの分化シグナル伝達の解析（中村史）
8.1 はじめに
8.2 抗IGF-II抗体とIGF-IIの相互作用の力学的解析
8.3 細胞表面IGF-IIの力学的検出
8.4 分化誘導過程における細胞表面IGF-IIの推移
8.5 おわりに
第3章 細胞内生体分子群の実測定量解析
1. 機能発現タンパク質の網羅的実測定量に向けて（森坂裕信，原圭祐，植田充美）
1.1 はじめに
1.2 細胞操作の新技術
1.3 プロテオーム解析システムの発展
1.4 次世代プロテオーム解析システムの構築のために必要な技術要素
1.5 新素材モノリスカラム
1.6 シリカモノリスによるネイティブタンパク質分離
1.7 今後の展開
2. 変異タンパク質およびタンパク質ドメインを用いたshortRNAの回収，分離技術（三浦夏子，林絵理，植田充美）
2.1 はじめに
2.2 低分子ncRNAキャッチャーの構築とncRNAキャッチャーによる低分子RNAの吸着・解離
2.3 HPLCを用いたRNAの分離・解析
2.4 今後の展開
2.5 おわりに
3. 細胞模倣非対称2分子膜リポソームの構築（茺田勉，小松佑規，高木昌宏）
3.1 はじめに（膜の非対称性）
3.2 非対称2分子膜の作製
3.2.1 実験材料
3.2.2 W/O液滴の作製
3.2.3 非対称2分子膜リポソームの作製および観察
3.2.4 静置水和法による対称膜リポソームの作製
3.3 非対称リポソームの解析
3.3.1 液滴・リポソームのサイズ分布
3.3.2 内外層膜の染色
3.3.3 非対称2分子膜リポソームのドメイン構造
3.4 おわりに
4. フローサイトメトリーとGFPレポーターによるG蛋白質シグナルのシングルセル解析（石井純，田中勉，荻野千秋，近藤昭彦）
4.1 はじめに
4.2 緑色蛍光蛋白質（GFP）とフローサイトメーター
4.3 G蛋白質共役型受容体（GPCR）
4.4 酵母フェロモンシグナル伝達経路を利用したGFPレポーターによるGPCRアッセイ系
4.5 FAR1遺伝子破壊株におけるシグナル伝達のフローサイトメトリー解析
4.6 モデルGPCR発現系でのシグナル伝達のフローサイトメトリー解析
4.7 セルソーターによるシグナル活性化細胞群と非活性化細胞群の分取および解析
4.8 おわりに
5. 代謝物情報のデータマイニング（馬場健史，福崎英一郎）
5.1 はじめに
5.2 多変量解析について
5.3 機器分析データの変換について
5.4 代謝物データベースについて
5.5 GC/MSデータからの代謝物迅速簡易同定法について
5.6 おわりに
6. マイクロアレイとその応用（伊藤嘉浩）
6.1 はじめに
6.2 マイクロアレイ測定原理
6.2.1 マイクロアレイ作製法
6.2.2 検出法
6.2.3 自動化システム
6.3 マイクロアレイの種類
6.3.1 分析用マイクロアレイ
6.3.2 機能探索用マイクロアレイ
6.3.3 リバース型
6.3.4 マイクロアレイの複合化
6.4 おわりに
7. 蛍光相関分光法による単一細胞内生体分子の定量解析（佐々木章，金城政孝）
7.1 はじめに
7.2 蛍光相関分光法（FCS）の原理
7.2.1 装置
7.2.2 単一分子検出
7.2.3 分子の運動と蛍光強度のゆらぎ
7.2.4 FCSの解析方法
7.3 単一細胞から抽出された生体分子の定量
7.4 おわりに
8. ナノLC/MSを用いた代謝物微量解析（和泉自泰，福崎英一郎）
8.1 はじめに
8.2 HPLCカラムのダウンサイジングとESI-MSにおける検出感度向上の原理
8.3 ナノLC/MSシステム
8.4 ナノLC/MSによる実用的代謝物プロファイリングへの応用
8.4.1 植物ホルモン類の網羅的高感度定量分析
8.4.2 高空間分解能でのファイトアレキシン定量分析
8.5 おわりに
9. タンパク質間相互作用検出法を用いたシグナル伝達分子リン酸化過程のイメージング（長棟輝行）
9.1 はじめに
9.2 FRET法を用いたタンパク質の均一系サンドイッチ免疫測定法の原理
9.3 EnhancedFRETImmunoassay法の細胞内シグナル伝達分子タイムラプスイメージングへの応用
9.4 おわりに
第4章 mRNAをターゲットとしたデジタル精密計測技術の開発
1. 一細胞からのmRNAをデジタル計測するための要素技術開発（竹山春子，岡村好子，吉野知子，神原秀記）
1.1 はじめに
1.2 パイロシークエンスによる網羅的遺伝子発現解析へのアプローチ
1.2.1 パイロシークエンスによるmRNA発現解析のための一分子PCR技術開発
1.2.2 パイロシークエンスのための一分子PCR増幅
1.3 パイロシークエンスで使用する酵素の集積化技術開発
1.3.1 ピロリン酸検出に利用される酵素
1.3.2 パイロシークエンスの要素技術
1.3.3 バイオナノ磁性ビーズ上への酵素集積化
2. Microcavityarrayを用いた細胞集積化技術とmRNA発現解析への応用（松永是，細川正人）
2.1 はじめに
2.2 これまでの細胞チップを用いた単一細胞マニピュレーションの研究例
2.3 Microcavityarrayを用いた細胞集積化技術の開発
2.4 Microcavityarrayを用いたon-chipFISH法による一細胞mRNA発現解析
2.5 稀少細胞の検出・回収に向けたMicrocavityarrayの応用
2.6 おわりに
3. 単一細胞由来mRNA回収プローブの開発（珠玖仁，伊野浩介，末永智一）
3.1 はじめに
3.2 リング電極プローブによる電場破砕法
3.3 マイクロ流体プローブによるmRNA定量解析
3.4 レポーターシステムにおけるmRNAとタンパク質の発現定量
4. アデノウイルスと人工ベクター間の細胞内DNA挙動ならびにmRNA発現量解析―人工遺伝子ベクターの改良に向けたアプローチ―（秋田英万）
4.1 はじめに
4.2 人工ベクター開発における細胞内動態解析の重要性
4.3 アデノウイルスとの細胞内動態比較に基づく人工ベクターの律速段階の同定
4.4 核移行後の発現効率差を生み出すメカニズムの解明
4.5 核内動態制御の重要性を示す実例
4.6 おわりに
5. 修飾基質アナログを用いたポリメラーゼ反応系と遺伝子配列解析法（耼原正靖，梶山智晴）
5.1 はじめに
5.2 修飾基質アナログを用いたポリメラーゼ反応
5.3 ピロシーケンシング法
5.3.1 しくみと特長，従来法との比較
5.3.2 修飾ヌクレオシド三リン酸（dATPαS，C7dATP）
5.4 修飾基質アナログの化学構造とピロシーケンシングにおける特性
5.5 おわりに
6. 全mRNAおよびタンパク質の絶対量計測のための基盤技術開発（紀藤圭治）
6.1 はじめに
6.2 mRNAの絶対量計測
6.2.1 GATC-PCR法
6.2.2 絶対量計測の高精度化
6.2.3 出芽酵母におけるトランスクリプトームの絶対量計測
6.3 タンパク質の絶対量計測
6.3.1 PCS-MS法
6.3.2 出芽酵母を対象とした絶対量計測
6.4 おわりに
7. テーパー状流路を用いた単一細胞からの瞬間RNA抽出と解析研究（高村禅）
7.1 はじめに
7.2 単一細胞よりRNAを抽出し解析するための要素技術の開発
7.2.1 一細胞の捕捉とリリース機構
7.2.2 層流を使った細胞の瞬間破砕機構
7.2.3 RNAのトラップと濃縮機構
7.2.4 RNA検出機構
7.2.5 一細胞mRNA解析用集積化チップの開発
7.3 まとめ
8. 人工核酸によるRNAの検出と精製（大槻高史，北松瑞生）
8.1 はじめに
8.2 RNAの検出と精製に用いられる人工核酸の構造と特徴
8.3 PNAによるRNAの精製
8.4 PNAアレイによるmiRNAの検出
8.5 おわりに
9. シミュレーテッドアニーリングによる多重プライマー配列デザイン法―細胞内mRNA絶対定量に向けて―（藤渕航）
9.1 はじめに
9.2 細胞解析とパイロシーケンサー
9.3 高速・高性能プライマー設計システム
9.3.1 候補配列の特異性高速検索
9.3.2 プライマーのTm値の計算
9.3.3 多重プライマーセット探索
9.4 多重プライマーセットの（準）最適解探索結果
9.5 RT-PCR実験によるプライマーの検証
9.6 自動検索システム
9.7 おわりに
10. 1細胞分離技術を用いたがん特異的免疫細胞の遺伝子スクリーニング法の開発（秋山靖人，新垣篤史）
10.1 研究の背景
10.2 研究の目的
10.3 研究の方法
10.3.1 がん患者の免疫細胞由来の1細胞遺伝子解析の工程について
10.3.2 がん抗原特異的なTまたはB細胞の検出
10.3.3 1個の免疫細胞の捕獲およびTCR，抗体遺伝子の増幅・クローニング
10.4 研究結果
10.4.1 免疫細胞の染色とフローサイトメトリーでの検出および選別
10.4.2 細胞アレイを用いたCTL細胞の1細胞レベルでの検出と遺伝子発現解析
10.4.3 1個の免疫細胞の選別およびTCR，抗体遺伝子の増幅・クローニング
10.5 考察
第5章 今後の展開（神原秀記，松永是，新垣篤史，植田充美）
1. はじめに
2. 波及するライフサーベイヤ研究成果
3. 今後の展望
